实时荧光定量PCR引物设计
实时荧光定量PCR作为实验室最常用的实验。研究基因在mRNA表达水平,以及验证基因敲除后下游靶基因变化情况等等。
首先，实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
最常用的方法有SYBRGreenⅠ与 TaqMan探针法。下面介绍一下原理：
1.
SYBRGreenⅠ法：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
2.
TaqMan探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。因此他每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
在进行实时荧光定量PCR引物设计之前，大家都应该了解引物设计需要注意的一些细节与原则.
下面介绍两个在线设计实时荧光定量PCR引物的网站，不用安装软件，直接上网就可搞定。
一
Primerbank。
网址：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
1.首先进入网站主页，选择Keyword, 根据自己需求选择种属以及基因名称。
2.点击 submit 后可以看到以下界面，网站会推荐多对引物，可以根据引物长度、Tm值选择。
二
Primer3plus。
网址;http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi
1. 在 PUBMED 获得基因序列后，在 primer3plus 主页上输入基因序列。
2. 点击general setting, 设置引物扩增长度，一般可设置扩增长度偏大一些，然后根据推荐引物选取合适扩增长度。
3. 点击pick primers后，首先会看到优选推荐的一对引物，同时在序列中看到引物所在位置。Primer3plus 网站中可以看到引物 Tm 值以及 GC含量。
三
设计好引物之后，
最好在NCBI的BLAST里检验一下引物的特异性，再交给公司合成。
1. 进入 pubmed 主页，点击 BLAST 中 Nucleotide Blast。
2. 选一条引物序列输入对话框，点击BLAST。
3. 网页打开后，会看到如下界面，不同颜色代表对引物序列的评分，一般会选择40分以上，即至少蓝色。继续下拉网页会看到序列详细信息，物种分类、基因名称以及序列位置。
“医学方”始终致力于服务“医学人”，将最前沿、最有价值的临床、科研原创文章推送给各位临床医师、科研人员
医学方已推出“实验室那些事儿”“SCI写作技巧”“文献精读与解析”“医学英语轻松学”“国自然基金申请”“临床数据挖掘”、“基因数据挖掘”、“R语言教程”、“医学统计学”、“微创动物实验培训”等多个专题课程，如需了解课程详细推文，可关注“医学方”公众号，点击“精品专题”进入
腾讯课堂：https://medfun.ke.qq.com
网易云课堂：http://study.163.com/u/ykt1467466791112
客服电话：15821255568
客服微信：yixuefang1234
温馨提示：医学方还设有专门的讨论群哦~各位明星导师都在群中，可以解答各位的遇到的问题，如有兴趣，可以加客服微信后加入群聊~返回搜狐，查看更多
