引物设计的工具有很多，这里给大家分享几款好用的设计工具，有软件版的也有在线版的。软件首推Oligo 6 和Primer Premier 5 ，Primer Premier 5的特色是自动搜索、Oligo 6 的特色是分析评价；在线的工具，首推Primer-BLAST以及primer 3，功能实用，简单且容易操作！
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Oligo 6 、Oligo 7安装包
Primer Premier 5、Primer Premier 6安装包
Primer Express安装包
Beacon Designer 8安装包
FastPCRy安装包
5款引物设计软件
1、Primer Premier 5/6
Primer Premier可以给定条件，让软件自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来。自动搜索功能的实现以Premier 为第一选择，Oligo软件也是不错的选择。其他软件如Vector NTI Suit, Dnasis, Omiga, Dnastar都带有引物自动搜索功能但不如Premier好用。
Premier主要由：GeneTank 序列编辑、 Primer 引物设计、Align 序列比较、Enzyme 酶切分析、Motif 基序分析这些功能板块组成。
很多人习惯于用5.0这个经典版本，并且认为比后来的更新版本更好用，我们也更推荐用Primer Premier 5.0。
2、Oligo 6/7
引物分析评价验证功能只有少数商业版软件能够做到，其中以Oligo 软件做的最为出色。（Oligo更推荐版本7）
Oligo主要用于引物探针的设计，引物探针的验证，一般用来和Primer Premier配套设计PCR引物。
Oligo主要用来设计和分析序列和PCR引物，合成基因和各种探针，包括小分子干扰核苷酸和分子信标的工具。程序具备基于最近邻热力学数据，低聚糖的搜索算法寻找最佳引物PCR，包括TaqMan、高度多路复用，共识或简并引物，支持多个文件的批处理，适合于生物学中的应用。
3、Primer Express
Primer Express是一款用于设计引物和探针、荧光PCR探针的设计软件，包含自动设计和手动设计两种方式。能够精确计算寡核苷酸与荧光基团鳌合后的Tm值。可以预测引物与引物之间与模板之间等的二级结构。
4、Beacon Designer 8
Beacon Designer适用于所有的qPCR分析，可成功设计SYBR Green引物、TaqMan®探针、HRMA引物、MethyLight TaqMan®、LNA™ spiked TaqMan®、用于标准和NASBA®检测的分子信标、Scorpions®和FRET探针等，功能十分强大。
5、FastPCRy
一款引物设计软件，可用于设计引物和探针，尤其适用于荧光PCR探针的设计，可以精确计算寡核苷酸与荧光基团鳌合后的Tm值。可以预测引物与引物之间与模板之间等的二级结构。
这个软件好像没有破解本，找了一圈只有7天试用版，有资源的小伙伴可以分享到评论区，十分感谢。
引物设计在线工具
1、Primer-BLAST
官网：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi
Primer-BLAST可以胜任多种不同引物的设计，最擅长的领域是荧光定量PCR的引物设计方面。
我们在阅读文献的时候，会关注里面的一些基因，并且想通过下载这些基因序列进行进一步分析。但是，由于文章中的基因序列并没有给出所在的数据库的登录号，因此我们并不能直接知道文章作者中研究的完整CDS序列。但是，我们可以利用NCBI网站上的Primer-Blast工具，根据引物的特异性来反向blast，在特定物种中搜索到目标序列。
2、primer3 web
官网：http://primer3.ut.ee/
免费开源，有在线版，是设计普通PCR最常用的在线工具之一；支持批量设计引物，如果做tNGS时，批量的这个功能就非常的有用了。
进入Primer3web官网后，输入我们刚刚获取的基因信息。物种选择HUMAN，粘贴CDS，单击Pick Primers（获取引物）。
3、PrimerBank
官网：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
PrimerBank是一个经过验证的PCR引物公共资源库，该数据库使用的引物设计算法已经通过实时PCR实验进行了广泛的PCR特异性和效率测试。我们通过实时PCR、琼脂糖凝胶电泳和PCR产物测序测试了26855对引物，这些引物对应于27681个小鼠基因。基于琼脂糖凝胶电泳的设计成功率为82.6%（22187对成功引物）。
4、Primerexplore
官网：http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html
正确的引物设计是成功进行LAMP扩增的关键。推荐使用设计LAMP引物的专用软件PrimerExplore （http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html ）设计引物，设计中应特别注意碱基组成、GC含量和二级结构等问题。Tm 值可以通过最近邻法（Nearest Neighbour法）获得。
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