英国

TwistDx 

Inc

公司开发的重组酶聚合酶扩增

(Recombinase 

Polymerase 

Amplification

，

RPA)

，被称为是可以替代

PCR

的核酸检测技术。

RPA

技术主要

依赖于三种酶：能结合单链核酸

(

寡核苷酸引物

)

的

重组酶

、

单链

DNA

结合蛋白

(SSB)

和

链置换

DNA

聚合酶

。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应

温度在

37°

C

左右。

RPA

技术特点

常规

PCR

必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而

PCR

仪本质上就是一个

控制温度升降的设备。

RPA

反应的最适温度在

37

℃

-42

℃之间，无需变性，在常

温下即可进行。这无疑能大大加快

PCR

的速度。此外，由于不需要温控设备，

RPA

可以真正实现便携式的快速核酸检测。

据介绍，

RPA

检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸（尤其是

DNA

）模板

扩增到可以检出的水平，

从单个模板分子得到大约

1012

扩增产物。

而且

RPA

还

用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。

RPA

既可以扩增

DNA

也可以扩增

RNA

，

还省去了额外的

cDNA

合成步骤。

不仅可以对扩增产物进行终点检测，

还可以对扩增过程进行实时监控，

甚至可以

通过试纸条（侧流层析试纸条

LFD

）读取结果。

目前，

TwistAmp® 

试剂盒的扩增子长度在

500bp

以内。不过，经过特别优

化的

RPA

扩增，也可以生成更长的扩增产物，或者减慢扩增速度（便于定量），

甚至在更低的温度下进行反应。

RPA

技术原理

首先重组酶与引物结合形成的蛋白

-DNA

复合物，在双链

DNA

中寻找同源

序列。然后一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动

DNA

合

成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的

DNA

链与

SSB

结合，防止

进一步替换。

在这个体系中，

由两个相对的引物起始一个合成事件。

整个过程进

行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

RPA

扩增的基础体系

（

TwistAmp® Basic

）

含有

DNA

扩增所需的所有试剂，

只要准备好引物和模板就行。

扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测，

产物纯

化后可用于下游研究。

在这个基础体系中添入不同的酶和探针，就可以实现多样化的

RPA

应用。

举例来说，

TwistAmp® Basic RT

添加了逆转录酶，

可以对

RNA

模板进行一步法

扩增。