下面以常用内参GAPDH为例将验证过程介绍如下：

GAPDH的引物序列来自一片外文文献：

上游：AATGCATCCTGCACCACCAA    （此为3端-M）

下游：GTAGCCATATTCATTGTCATA    (此为3端-M)

所得片断为516bps。

      首先在NCBI中查到GAPDH的mRNA序列。

      然后打开Primer Premier5.0，点File→New→DNA Sequence,将上面的mRNA序列复制到NewSequence 框内，注意选择as is。

      先加上游引物：点Primer→点左上角s（sense)→点Edit Primers, 将上游引物复制到编辑框（用Ctrl+V快捷键），注意选择as is→点Analyze→点Prime，即可见输入的上游引物与模板匹配上了→点Ok。

      再加下游引物：点左上角A（antisense)→点Edit Primers, 将下游引物复制到编辑框（用Ctrl+V快捷键），注意选择reversed→点Analyze→点Prime，即可见输入的下游引物与模板匹配上了→点Ok。

      此时即可看到上游和下游引物的相关参数。

     注：在Primer Premier5.0中，上游引物的显示方向为5′→3′，下游引物为3′→5′，均为从左往右看。